В каждую пробирку (кроме 2-го контроля) добавляют по 3,15 мл egta-mg-
gvb и центрифугируют 5 мин. при 1600g. Измеряют od4i4. Вычисляют степень
гемолиза (у) с учетом поправок на контроль эритроцитов и комплемента
(см.п.2.2.2.1.). В логарифмическом масштабе строят график зависимости у/1-у от
объема комплемента. При 50 % гемолизе у/(1-у)=1. Графически находят объем
комплемента (К), вызывающий 50 %-ньш гсмолиз, что соответствует одной
гемолитической единице АСН5и.
Количество АСН5о в 1 мл (М) рассчитывают по формуле:

М = 0,5 n : К,

 где: n-величина обратная разведению комплемента, 0,5- коэфф. коррекции, т.к. в
используемом варианте объем реакционной смеси в 2 раза меньше, чем в
оригинальном. По данным yano Т., 1992, гемолитическая активность комплемента
карпа равна 58,9 j: 13,5, радужной форели - 345 +_ 108, тидяпии- 574 j: 250, барана
- 15,4, морской свинки - 11,9, собаки -14,4, человека -18,4.

2.2.3. Определение активности иптерферона спектрофотометри-ческим
методом (t.renault et al. 1991, с дополнением)

Разработано несколько методов определения активности интерфе-рона,
основанных на его способности ингибировать ЦПД вируса в культуре клеток,
снижать число бляшек в ней, подавлять титр вируса и синтез РНК. Титром
интерферона считают наибольшее разведение испытуемого материала,
уменьшающее на 50% показатель активности вируса в контроле. При
исследовании большого количества образцов часто используют микрометод
титрования интерферона в культуре клеток. При этом очень важно выбрать
соответствующую систему "культура клеток - вирус". Вирус должен иметь
высокую чувствительность к интерферону и вызывать в культуре клеток четкие
изменения, приводящие к разрушению монослоя. Используют культуру клеток
гомологичную интерферону и высоко чувствительную к его защитному действию.
Для титрования интерферона лососевых рыб наиболее распространенной является
система: rtg-2-ipnv; ддя карпа - ЕРС- svcv. В качестве источника интерферона
используют сыворотки рыб, в случае исследования мальков - го-могенат тушек
рыб.

2.2.3.1. Принцип метода. Спектрофотометрический микрометод титрования
интерферона основан на различии оптической плотности ин-тактного клеточного
монослоя и монослоя с признаками ЦПД после окрашивания соответствующими
красителями. За единицу активности интерферона принимают такое разведение
образца, которое защищает 50% клеточного монослоя, то есть оптическая
плотность клеточного монослоя, обработанного этим разведением, равна 50%
оптической плотности контрольного неинфицированного монослоя.

2.2.3.2. Оборудование и реактивы: фотометр для работы с 96-луночными
микропанелями (ридер); дозирующие микропипетки (1- и 8-канальные на 0,2 мл);
96-луночные культуральные микропанели; СС>2 - инкубатор или термостат с
эксикатором и со свечкой; инвертированный микроскоп; стерильная фильтровальная бумага; вирус; культура клеток; ростовая и поддерживающая
среды, необходимые для выбранной культуры клеток (ростовая среда содержит
10% сыворотки, поддерживающая - 2%); 1%-ный раствор кристаллвиолета в 20%
этанояе.

2.2.3.3. Подготовка образцов интерферона к исследованию. Сыворотки
получают общепринятым способом. Гомогенат готовят на поддерживающей среде
в соотношении 1:4. Центрифугируют 15 мин при 3500g и собирают супернатант.
Сыворотки или супернатант освобождают от вируса (если его использовали в
качестве индуктора интерферона) одним из" способов: прогреванием (время и
температура зависят от использованного вируса; vhsv - 30 мин при 45° С );
ультрацентрифугированием - 4 часа при looooog ; низким рН (добавляют НС1
до рН 2,0, выдерживают 24-48 часов при +4° С, восстанавливают рН до 7.0 добав-
лением naoh).

Если в качестве индуктора использовали дсРНК или другие препараты (но не
вирусы), эта процедура исключается. Содержащие интерфе-рон образцы можно
хранить при -20° С и ниже.

2.2.3.4. Подготовка рабочей дозы вируса. Вирус накапливают в наиболее
чувствительной культуре клеток и титруют методом серийных 10-кратных
разведении. Готовят вируссодержащую суспензию в поддерживающей среде с
титром 4х103 БОЕ/0.2 мл для системы rtg-2 - ipnv и 100 ТЦД5о/0,2 мл для
системы epc-svcv.

2.2.3.5. Подготовка суспензии клеток. Суспензию клеток готовят в ростовой
среде с такой концентрацией клеток, чтобы через сутки образовался монослой
(rtg-2 - 95х103 клеток/О. 1 мл; ЕРС - 80-85х103 клеток/О. 1 мл).

2.2.3.6. Техника титрования ингерферона. Восьмиканальной микропипеткой
готовят 2-кратные разведения образцов интерферона на ростовой среде в 96-
луночной микропанели (для каждого разведения используют 3-4 лунки) по 0,1
мл/лунка. Чтобы исключить неспецифическое и токсическое действие образцов,
титрование начинают с разведения 1:8, а количество разведении зависит от
предполагаемого титра интерферона. Обычно достаточно конечного разведения
1:1024.

В качестве контролей используют: 1 - контроль клеток (в 3-4 лунки вносят по
0.1 мл ростовой среды); 2 - контроль на токсичность образца (в 3-4 лунки вносят
по 0.1 мл образца, разведенного 1:8); 3 - контроль рабочей дозы вируса (в 6-8
лунок вносят по 0.1 мл ростовой среды).
Во все лунки (опытные и контрольные) вносят по 0,1 мл суспензии клеток.
Микропанели закрывают крышкой и помещают в СОг-инкубатор при температуре,
оптимальной для роста культуры клеток (20° С для rtg-2, 25° С для ЕРС). При
отсутствии СО; - инкубатора можно использовать эксикатор, в который помещают
микропанели, зажигают свечу, закрывают крышку и ставят в термостат с
указанной температурой. Для герметизации края крышки эксикатора обмазывают
вазелином. Через 18-20 час инкубации микропансли открывают, переворачивают и
аккуратно стряхивают, чтобы удалить среду. Края панели промокают стерильной
фильтровальной бумагой. Во все подопытные лунки и лунки контроля рабочей дозы вируса вносят по 0.2 мл рабочей дозы вируса. В лунки контролей 1 и 2 вносят по 0,2 мл
поддерживающей среды. Микропанели закрывают и помещают в СО-г - инкубатор при температуре, оптимальной для репродукции вируса. Инкубируют до развития ЦПД на 100% в лунках с контролем рабочей дозы вируса.

2.2.3.7. Учет результатов и расчет активности интерферона.

Среду из микропанслсй удаляют стряхиванием, клетки окрашивают в
течение 10 мин 1%-нь1м раствором кристаллвиолета в 20%-ном этаноле.
Краситель удаляют, а клетки промывают 3 раза водой и высушивают.
Краситель элюируют 70%-ным этанолом (0.1 мл/лунку) и определяют od595.
Можно определять оптическую плотность клеток без элюиро-вания, сразу после
высушивания. Рассчитывают среднее значение od595, для лунок с контрольными
клетками (odmax), с рабочей дозой вируса, т.е. при 100% поражении монослоя
(odmin), а также среднее значение od595 для каждого разведения интерферона.
Оптическую плотность образцов при 50% защите клеток определяют по
формуле:
od5o = (odmax - odmin):2

Количество единиц активности интерферона в 1 мл образца (Аиф ) рассчитывают по формуле:
Аиф= 1/vtn + [(Т n+1 - tn) x (odn - odmin - od5o):(odn - odn+1 v - объем образца, 0.1 мл;
t,i -величина, обратная разведению образца, дающему больше 50% защиты
клеток от инфекции; Т пн - величина, обратная разведению образца, дающему меньше 50% защиты клеток; odn - оптическая плотность образца, защищающего больше 50% клеток; od,n+1 - оптическая плотность образца, защищающего меньше 50% клеток.

При отсутствии фотометра долю непораженных клеток в каждой лунке (в
процентах) определяют приблизительно, исследуя микропанель под
инвертированным микроскопом. Активность интерферона рассчитывают по этой
же формуле, подставлял вместо величины оптической плотности долю
непораженных клеток (в процентах). Специфическая иммунная система
Специфическая иммунная система состоит из клеточных и гуморальных
компонентов. От неспецифических факторов они отличаются специфичностью
взаимодействия с чужеродными агентами. Специфичность иммунных реакции
определяется лимфоцитами и иммуноглобули-нами.
Состояние специфического звена иммунной системы рыб важно знать при
оценке иммунного статуса, определении потенциальных возможностей организма
рыб противостоять воздействию агрессивных факторов среды и установлении
характера влияния иммуномоду пирующих к вакцинных средств. Оно оценивается
по данным анализа клеточных и гуморальных факторов иммунитета.

3.1. Клеточные факторы

Основную роль в формировании специфического клеточного иммунного
ответа рыб на чужеродные агенты играют лимфоциты.

3.1.1. Лимфоциты

3.1.1.1. Метод определения абсолютного и относительного содержания
лимфоцитов основан на установлении относительного числа лимфоцитов в
процентах по лейкоцитарной формуле и проведении расчета содержания клеток,
приходящихся на долю лимфоцитов из общего количества лейкоцитов,
обнаруженных в 1 мл крови при прямом подсчете.

3.1.1.2. Определение Т- и В-лимфоцитов.

Существуют разнообразные способы определения Т- и В-лимфоцитов в
организме рыб. Они основаны на учете характера реагирования лимфоцитов с
маркерами или со специфическими антисыворотками против отдельных
клеточных популяций. В качестве маркеров используют эритроциты барана,
мышей, зимозан, Т и В-зависимые митоге-ны (конкавалин А, фитогсмагглютинин,
липополисахариды, птичий туберкулин) и т.д. Для оценки качественного состава и
количества отдельных типов клеток применяются методы розеткообразования или
реакция бластрансформации.

   Определение   содержания   Т-лимфоцитов   методом   Е-
розеткообразования.
Принцип метода. Т-лимфоциты в организме позвоночных, в т.ч. рыб,
выполняют разнообразные функции, связанные с распознаванием "своего" и
"чужого" и поддержанием генетического постоянства внутренней среды. Данный
показатель используется при оценке состояния Т-клеточного иммунитета. Т-
лимфоциты несут на своей поверхности рецепторы для эритроцитов барана (ЭБ).
Благодаря наличию таких рсцепторов Т-лимфоциты способны вступать в реакцию
с эритроцитами барана и образовывать так называемые розетки. Подсчитав
количество Е-розеткообразующих клеток, судят о количественном содержании
(относительном и абсолютном) Т-лимфоцитов в исследуемом образце.

Оборудование, реагенты и реактивы: 0,5 %-ная суспензия эритроцитов
барана; раствор Олсвера; фосфатный буфер (рН-7,4); раствор Хсн-кса (или среда
199); 3 %-ный раствор глутарового альдегида; метиловый зеленый; пиронин;
хлороформ; лимфоциты; фикол-верографин (плотностью -1,007 г/мл);
силиконизированные или пластиковые пробирки; центрифуга настольная;
пипетки, пробирки центрифужные; гспарин; кровь рыб; микроскоп; камера
Горяева.

  Материалы для исследования, ход определения и учет результатов.
Из крови рыб выделяют лимфоциты путем центрифугирования в градиенте
фикол-верографина. В силиконизированную пробирку, смоченную раствором
гепарина (или цитрата натрия), набирают 1 -2 мл крови рыб, разводят 1:1
раствором Хснкса; на дно сухой пробирки аккуратно наливают 1,5-2 мл градиента
плотности; наклонив пробирку под углом 45°; пробирки цснтри4)угируют при i500
об/мин в течение 40 минут; после центрифугирования пипеткой собирают кольцо
лимфоцитов, находящееся между слоями плазмы и градиентом плотности; клетки
дважды отмывают раствором Хенкса при 1500 об/мин в течение 10 минут; под-
считывают концентрацию лимфоцитов в камере Горяева и доводят раствором
Хенкса (или средой 199) до 2 млн. кл/мл. - трижды отмытые эритроциты барана
разводят средой 199 до 0,5% концентрации. В силиконизированную пробирку
объемом 1-2 мл вносят 0,1 мл 0,5% раствора эритроцитов барана, к эритроцитам
барана добавляют 0,1 мл суспензии лимфоцитов (2 млн. кл/мл), смесь инкубируют
5 мин при 26° С, после инкубации смесь центрифугируют в течение 5 мин при 750
об/мин и инкубируют при 26° С в течение 1 часа. По истечении инкубации клетки
фиксируют глутаровым альдегидом (0,05 мл 3% раствора) и после отмы-вания от
глутарового альдегида делают мазки. Мазки фиксируют в метаноле. красят метил-
грюн-пиронином по Брашс и микроскопируют. Число Н-розеткообразующих
клеток в процентах вычисляют в результате подсчета 200-300 лимфоцитов в
препарате. За розеткообразуюшую клетку (РОК) принимают лимфоцит,
присоединивший нс менее 3 эритроцитов барана. Абсолютные цифры Е-
розеткообразующих клеток в 1 мкл выводят на основании количества лимфоцитов
в 1 мкл крови. Лимфоциты можно выделить из суспензии клеток селезенки,
лимфоидной ткани про-и мезонефроса и тимуса.

• Определение Т-, В-, Д-И 0-лимфоцитов (по Мэндес, 1973).
Принцип метода. При смешивании лимфоидных клеток рыб с эритроцитами
барана (ЭБ), частичками зимозана, сенсибилизированными макроглобулиновыми
антителами с комплементом, происходит их избирательная адсорбция
лимфоидными клетками: на Т-лимфоцитах адсорбируются эритроциты барана, на
В-лимфоцитах - частицы зимозана, на Д-лимфоцитах - частицы зимозана и
эритроциты барана; 0-лимфоциты остаются свободными от эритроцитов и
частичек зимозана. Данный метод применяется для идентификации
популяционной структуры лимфоцитов.

Компоненты, материалы и оборудование. Лф - суспензия лим-({юцитов рыб,
концентрацией 2 млн. клеток/мл, в среде 199 (или Хснкса). Способ получения Лф
(см. выше). ЭБ - 0,5%-ная взвесь эритроцитов барана - индикаторы для Т-
лимфоцитов; частицы зимозана конъюгирован-ньге с комплементом (индикаторы
для В-лимфоцитов). Разбавители: физ-раствор, среда 199. Материалы и
оборудование: гепарин, хлористый аммоний, 0,2%-ный раствор трипановой сини,
глутаральдсгид,разделяющий раствор с плотностью 1,077 г/мл,
силиконизированныс цснтрифужные и другие пробирки, пипетки, счетные камеры
Горяева или Бюркера, холодильник, фазовоконтрастный микроскоп.

Техника постановки реакции. В силиконизированную пробирку приливают
по 0,1 мл взвеси лимфоцитов, 0,5%-ной взвеси эритроцитов барана и частички
зимозана с комплементом. Смесь клеток инкубируют 5 мин при 26°С,
центрифугируют 5 мин при 800-1000 об/мин и вновь инкубируют при 12° С - 60
мин. Осадок осторожно ресуспендируют, наносят каплю взвеси клеток на
предметное стекло, накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Из капли
взвеси можно готовить мазки на предметных стеклах и покрасить их но
Романовскому-Гимза.

Учет и оценка результатов реакции осуществляются одновременно и
параллельно в световом и фазово-контрастном микроскопах. Просматривают 200
лимфоцитов и определяют процент РОК. Т-лимфоцит образует розетку из 3 и
более ЭБ, В-лимфоцит - из 3 и более частиц зимозана;
Д-лимфоцит образует смешанную розетку - 2 ЭБ + 2 и более частиц зимозана; 0-
лимфоцит розеток не образует.

3.2. Гуморальные факторы

3.2.1. Имуноглобулины. Они являются биохимической основой
специфического гуморального иммунитета, выполняют функцию специфических
антител к конкретным антигенам, синтезируются плазматическими клетками (В-
лимфоцитами) и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная их
часть относится к гамма - глобулиновой фракции сыворотки крови.

Страницы: 1, 2, 3, 4