|
|
Госсипол представляет собой кристаллический канареечно-желтый порошок без запаха. Растворим - в спирте, эфире, ацетоне, хлороформе, пиридине. Не растворим - воде. Качественные реакции. Кристаллик госсипола с каплей конц. серной кислоты на часовом стекле дает пурпурно-красное окрашивание. Диоксим C30H32O8N2. В колбе с обратным холодильником нагревают на водяной бане 0.5 г госсипола, 1 г гидроксиламина гидрохлорида, 5 мл пиридина и 5 мл абсолютного спирта. Растворитель концентрируют под тягой, к остатку прибавляют спирт. Выпадают кристаллы; их отделяют и перекристаллизовывают из спирта. Т.пл. 312°C. Госсипол является одним из главных пигментов хлопчатника, известен в трех таутомерных формах. Обладает свойствами антиоксиданта, щелочные растворы поглощают свободный кислород воздуха. Ядовит. В ядрах семян и других частях хлопчатника содержание госсипола в среднем составляет 1%. В процессе производства хлопкового масла он превращается в глубокоокрашенные не токсичные соединения, затрудняющие рафинацию масла. В настоящее время наряду с фармацевтической отраслью применяется для получения полимерных материалов, преимущественно лаков. ЛАБОРАТОРНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Сырье и реактивы. | ||||||||
Исходное сырье |
Количество |
Примечание |
|||||||
Кора корней хлопчатника |
250 г |
В коре корней хлопчатника содержится больше госсипола, чем в других частях растения. Отсутствие в ней жирных веществ облегчает выделение и очистку. |
|||||||
Эфир |
1000 мл |
Для удаления перекисей эфир встряхивают с 5% раствором сернокислого железа(II), подкисленного серной кислотой. |
|||||||
Уксусная кислота |
25 мл |
|
|||||||
Петролейный эфир |
25 мл |
|
|||||||
Гидросульфит натрия |
1 г |
|
|||||||
Этиловый спирт |
50 мл |
|
|||||||
Пиридин |
5 мл |
|
|||||||
Гидроксиламин гидрохлорид |
1 г |
|
1 Стадия. Выделение госсипола в виде госсиполацетата.
Госсиполацетат - молекулярной комплекс состава C30H30O8* CH3COOH, легко гидролизуемое горячей водой.
Грубоизмельченную воздушно-сухую кору корней хлопчатника перколируют при пониженной температуре 1 л эфира, свободного от перекисей. Эфирный экстракт концентрируют при небольшом разрежении до объема 40-50 мл, добавляют 15 мл ледяной уксусной кислоты, хорошо перемешивают и, не закрывая колбы, оставляют в холодильнике для кристаллизации. При медленном испарении эфира выпадает госсиполацетат. Первую порцию зеленовато-желтых кристаллов отфильтровывают на стеклянном фильтре и промывают 10 мл смеси эфира и уксусной кислоты в соотношении 3:1.
Фильтрат и промывную смесь объединяют и оставляют в стакане при комнатной температуре, пока не испарится половина объема. В это время выпадает вторая половина госсиполацетата. Соединив вместе полученные осадки, их растворяют в 50 мл эфира, добавляют 5 мл уксусной кислоты и оставляют на сутки. Выпадает чистый госсиполацетат в количестве 3 гр.
2 Стадия. Получение свободного госсипола.
На холоду растворяют 3 г госсиполацетата в 50 мл эфира, свободного от перекисей, и переносят в коническую колбу, содержащую равный объем 0.4%-ного водного раствора дитионита натрия (неверно называемый гидросульфитом натрия).
Эфир отгоняют при температуре бани около 60°C под умеренным вакуумом. По мере испарения эфира на поверхности воды выделяется свободных госсипол в виде корочки. Для полноты гидролиза госсиполацетата эту операцию повторяют еще раз, т.е. отфильтрованный осадок снова растворяют в эфире, добавляют равный объем воды, эфир отгоняют. Полученный таким образом госсипол высушивают на воздухе. Получают 2 гр.
Для очистки всю порцию госсипола растворяют в 25 мл эфира и добавляют петролейный эфир до помутнения раствора. Раствор оставляют на кристаллизацию. Кристаллический госсипол - канареечно-желтый порошок, хранят в пробирке из темного стекла. Получают чистого госсипола 1-1.2 г, имеющего т. пл. 180-181°C.
Способность лейкоцитов человека продуцировать интерферон была показана вскоре после открытия системы интерферона Айзексом /Франция/.
Методика заключается в следующем.
Из периферической крови доноров выделяют лейкоцитарную массу и подвергают культивированию в суспензии. Используют среду №1, в которую добавляют 0,0015 ед/мл инсулина и 100-200 ед/мл нативного интерферона. К лейкоцитам в концентрации (5-10)*106клеток/мл в качестве индуктора добавляют вирус болезни Ньюкасла с инфекционным титром не ниже 108/мл ТЦД50 в культуре куриных фиброластов. Продуцированный интерферон отделяют от культуральной среды путем центрифугирования.
ПОЛУЧЕНИЕ БЕТА -ИНТЕРФЕРОНА
Еще в 60-е годы было показано, что интерферон, провоцируемый клетками амниона человека, а также кожно-мышечными фибробластами, по своим свойствам отличается от лекоцитарного интерферона. В настоящее время для получения бета-интерферона используют диплоидные клетки человека. Супериндукцию осуществляют различными воздействиями - дихлоро-1-бета-D-рибафуранозилбенэимидазолом, хлороквином, нейтральным красным, УФ~радиацией и др.
ПОЛУЧЕНИЕ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА
Гамма-интерферон является продуктом Т-лимфоцитов человека. За последнее десятилетие благодаря усиленному изучению иммунного ответа и свойств иммуннокомпетентных клеток значительно расширились представления о функциях Т-лифоцитов, а также о продуктах, выделяемых Т-лимфоцитами - лимфокинах, обладающих свойствами биорегуляторов.
Гамма-интерферон, или иммунный интерферон, также является одним из активных регуляторов иммунного ответа, так как обладает супрессорной активностью в отношении продукции антител, вызывает активацию естественных киллеров.
Гамма -интерферон продуцируют активированные Т-лимфоциты.
Для получения больших количеств гамма-интерферона из периферической крови выделяют Т-лимфоциты и обрабатывают митогеном или антилимфоцитарной сывороткой. Например, к культуре с концентрацией лимфоцитов (I-2)*105 в 1 мл прибавляют стафилококковый энтеротоксин в концентрации 0,02 мкг/мл.
Культуры инкубируют в среде с человеческим альбумином. Интерферон выделяют из культуральной среды. Возможно повторное стимулирование культуры и повторное продуцирование интерферона.
ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ ИНТЕРФЕРОН
Характеристика готового продукта,
Человеческий лейкоцитарный интерферон является видоспецифическим гликопротеидом, синтезируемым донорскими лейкоцитами в ответ на воздействие интерфероногена.
Специфичность препарата определяется следующими признаками:
А) противовирусной активностью. В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса, взятого в дозе 100 ТЦД50
Б) устойчивостью активности к действию нуклеаз-РНК-азы и ДНК-азы;
В) чувствительностью активности к действию трипсина - при концентрации фермента 300 мкг/мл в течение I часа при 37°С препарат полностью инактивируется;
Г) чувствительностью активности к действию специфической антисыворотки - антиинтерфероновая сыворотка в разведении, соответствующем титру должна снижать защитное действие интерферона, взятого я количестве 10 ед, в реакции нейтрализации.
Основные требования к препарату.
Препарат должен быть вирусологически стерильным, нетоксичным и безвредным.
В разведении, соответствующем титру активности, препарат должен защищать культуру человеческих клеток от цитопатического действия индикаторного вируса.
Сухой препарат - пористый порошок серовато-коричневого цвета, легко растворимый в 2 мл дистиллированной воды. Остаточная влажность не должна превышать 2%,
Раствор препарата должен иметь различные оттенки красного цвета и желтоватый оттенок.
ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
Кровь заготавливают на станциях переливания крови в соответствии с действующими инструкциями, в стерильные многокамерные мешки или флаконы, заполненные консервирующим раствором.
Пластикатные мешки центрифугируют 4 мин при 4°С и из них выжимают последовательно - плазму, а затем 40 мл верхнего слоя с поверхности клеточной фракции (эритромасса) или 40 мл верхнего слоя клеточной фракции (лейкомасса), которые используют в дальнейшем в качестве источника лейкоцитов для биосинтеза препарата.
Образец крови, плазмы, эритромассы или лейкомассы от каждого донора, должен контролироваться на отсутствие инфицирования сифилисом, гепатитом, СПИДом в соответствии с действующими инструкциями. При отрицательных результатах контроля эритромасса и лейкомасса могут использоваться для производства интерферона не позднее, чем спустя сутки после забора крови от донора. Хранение их допускается при температуре не выше 4°С.
Плазма или сыворотка донорской крови входят в состав культуральной смеси на всех стациях биосинтеза интерферона.
Культивирование и контроль проиизводственных штаммов вирусов, получение культур куриных и человеческих фибробластов.
В производстве интерферона в качестве интерфероногена используется вакцинный штамм "Н" вируса болезни Ньюкасла. Это представитель группы парамиксовирусов, для которых характерна сферическая форма вирусов, и спиральная структура нуклеокапсида. Вирус легко репродуцируется в куриных эмбрионах и культуре куриных фибробластов, оказывая цитоплазтическое действие. Вирус неопасен для человека, однако может вызвать воспалительные явления при случайном попадании массивной дозы в глаз.
Индикаторным вирусом служит штамм "Индиана" вируса везикулярного стоматита.
Это представитель группы рабдовирусов, также имеющих спиральную структуру нуклеокапсул, но инфекционный вирион по форме напоминает пулю. Вирус хорошо репродуцируется в куриных эмбрионах, а также в культурах куриных и человеческих фибробластов, оказывая цитопатическое действие.
Необходимо соблюдать осторожность при работе с этим вирусом.
Методы культивирования вирусов
Вирус болезни Ньюкасла культивируют в 9-10-дневных куриных эмбрионах. Эмбрионы просматривают через овоскоп, павшие отбраковываются, а у жизнеспособных карандашом обводятся границы воздушной полости.
При исходном титре вируса 108-109 ТЦД50/мл заражающая доза составляет 0,2 мл разведения 10-4 . Эта доза вводится в эмбрион шприцем через воздушную полость с соблюдением условий стерильности. Место прокола в скорлупе заливается парафином и эмбрионы инкубируются 2-е суток при 37°С.
После инкубации эмбрионы охлаждают при 4°С в течение 3-4 часов, затем в строго стерильных условиях вскрывают со стороны воздушной полости и визуально оценивают их жизнеспособность. Павшие - отбраковывают, а из остальных пастеровской пипеткой (с помощью вакуума или груши) отсасывают алантоисную жидкость, которая и служит в дальнейшем источником вируса.
Вируссодержащую аллантоисную жидкость контролируют на бактериологическую стерильность. Определяют инфекционный титр в культуре куриных фибробластов и титр гемагглютининов.
Контроль на стерильность. осуществляют высевом I мл аллантоисной жидкости из каждого флакона на питательные cpeды - сахарный бульон и среду Сабуро. Посевы инкубируют в течение 7 суток, на сахарном бульоне при 37°С, а на среде Сабуро - при комнатной температуре.
Инфекционный титр определяют в культуре фибробластов. В 3-х суточную культуру со сформировавшимся монослоем клеток вводятся различные разведения (от 10-7 до 10-10) алантоисной жидкости. Культуры инкубируют 3-е суток при 37°С и затем просматривают под микроскопом.
Максимальные разведения, оказывающие в культуре цитопатическое действие, принимаются за ТЦД вируса (титр цитопатического действия).
_Титр гемагглютининов определяется стандартным методом постановки реакции гемагллютинации с использованием куриных эритроцитов (0,5%).
Титр гемагглютининов не является ведущей характеристикой вирусов и постановка реакции гемагглютинации не является обязательной для каждой партии вируса.
В производстве допускается использование только бактериологически стерильного вируса с инфекционным титром 10-8-10-9/1 мл ТЦЦ50 и титром гемагглютининов 250 - 1000.
Вирус болезни Ньюкасла представляет большую ценность для производства, поэтому должны быть приняты меры к тому, чтобы сохранить его чистоту и интерфероногенные свойства. Категорически запрещается непрерывное использование пассирование вируса: в качестве исходного материала при заражении используют лучшую партию вируса, которую после контроля разливают по I мл в ампулы и лиофилизируют.
После лиофилизации эта партия в дальнейшем считается рабочим стандартом вируса.
Рабочий стандарт вируса контролируют описанными методами на бактериологическую стерильность, инфекционный титр и титр гемагглютининов. Затем в обязательном порядке вирус идентифицируют.
Идентификацию вируса болезни Ньюкасла проводят постановкой стандартной реакции торможения гемагглютинации с антисывороткой. Антисыворотка в разведении, соответствующем титру, но не ниже, чем 1:1000, должна полностью подавлять агглютинацию куриных эритроцитов /0,5%/ при дозе вируса, равной 4АЕ.
Получение первично-трипсинизированных, культур кожно-мншечной ткани куриных и человеческих эмбрионов.
Новости |
Мои настройки |
|
© 2009 Все права защищены.