| Состояние глутатионового звена антиоксидантной системы крови практически здоровых людей с лор-патало... |
Активность GPO в живых клетках увеличивается при
действии ионизирующей радиации, интоксикации этанолом, акрилонитрилом, при
Е-авитаминозе. Особо важна роль GPO в условиях окислительного стресса, так как он предупреждает
возникновение и развитие пероксидации, устраняет ее источники и продукты, GPO – является одним из важнейших
компонентов ферментативной АОС [Брискин, Рыбакова, 2000].
Глутатион-S-трансфераза входит в семейство ферментов,
нейтрализующих токсическое влияние различных гидрофобных и электрофильных
соединений путем их коньюгации с восстановленным глутатионом, GST локализованы преимущественно в
цитозоле клеток. Основная функция GST-защита клеток от ксенобиотиков и продуктов ПОЛ посредством их
восстановления, присоединения к субстрату молекулы глутатиона или
нуклеофильного замещения гидрофобных групп:
ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O
R + GSH → HRSG
RX + GSH → RSG + HX
GST способны восстанавливать
гидроперокси-группы окисленных фосфолипидов непосредственно в мембранах без их
предварительного фосфолипидного гидролиза свободными жирными кислотами. Этот
фермент конъюгирует с GSН токсичные продукты ПОЛ
(ноненали, децинали, холестерин-α-оксид) и тем способствуют их выведению
из организма. Таким образом, GST
является важным компонентом антиоксидантной защиты, особенно от эндогенных
метаболитов, образующих при окислительном стрессе [Владимиров, 1998].
Глутатионредуктаза. Во многих реакциях,
катализируемых GPO и GST, две молекулы GST соединяются дисульфидной связью и
образуют окисленный глутатион. Для восстановления GSSG в клетках существует специальный
фермент – глутатионредуктаза [Зенков, Меньщикова, 2004].
ГР широко
распространенный флавиновый фермент, поддерживающий высокую внутриклеточную
концентрацию GSH, катализируя обратимое NFDFH– зависимое восстановление GSSG с образованием двух молекул GSH.
GSSG + NADFH + H+ → 2GSH + NADF+
ГР содержится в
основном в растворимой части клетки.
Глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа.
Для
восстановления окисленного глутатиона ГР в качестве донара водорода
используется NADFH, который образуется в
пентозофосфатном пути в ходе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакции [Андреев,
1999]
G6FD – фермент, катализирующий начальную реакцию пентозофосфатного пути:
восстановление глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат. Она состоит из двух типов
субъединиц, которые состоят из 479 аминокислотных остатков, имеют один и тот же
СООН - концевой участок, но разные NH2-концы, Эти субъединицы различаются по длине и
последовательности аминокислот. Реакцию, катализируемую G6FD, с кинетической точки зрения можно рассматривать как двухсубстратную
реакцию, протекающую с участием субстрата и кофермента, выполняющего роль
второго субстрата. Фермент очень сильно ингибируется NADFH и ATF, по типу конкурентного ингиирования.
Глутатион – трипептид (L-γ-глутамил-L-цистеинилглицин), который при
физиологических значениях рН имеет две отрицательно заряженные карбоксильные
группы и положительно заряженную аминогруппу.
Наличие
γ-глутамильной связи защищает трипептид от деградации внутриклеточными
пептидазами, а сульфгидрильная группа цистеина может служить донором
электронов, придавая глутатиону свойства восстановителя и способность удалять
свободные радикалы. Одноэлектронная реакция GSH со свободными радикалами приводит к образованию тиильного радикала GS., который при димеризации с другим GS. радикалом дает дисульфид глутатиона
(GSSG). Второй тип
окислительно-восстановительных реакций, в которых принимает участие глутатион -
это реакции тиол-дисульфидного обмена [Brune,1995]. При окислительно-восстановительных реакциях третьего типа
происходит двухэлектронное окисление с образованием интермедиата, который затем
реагирует со второй молекулой, идентичной первой или отличной от нее. При этом
в первом случае образуется GSSG, а во
втором-смешанный дисульфид.
В клетках всех
типов GSH синтезируется в ходе двух
последовательных реакций, катализируемых γ-глутамилцистеинсинтетазой
(γ-GCS) и GSН-синтетазой (GS). γ-GCS катализирует образование пептидной
связи между γ-карбоксильной группой глутамата и α-аминогруппой
цистеина. Глутатионсинтетаза образует пептидную связь между
α-карбоксильной группой цистеина в составе γ-глутамилцистеина и
α-аминогруппой глицина. Обе реакции являются ATF-зависимыми, имеют сходный
каталитический механизм и протекают через образование ацилфосфатного интетрмедиата
[Davies,1995].
Статус глутатиона
определяется как общая концентрация глутатиона и количественное соотношение
между различными формами, в которых он существует в клетке. Статус глутатиона
обусловлен динамическим равновесием между реакциями синтеза, деградации,
транспорта, окисления и восстановления и поэтому может изменяться в зависимости
от преобладания тех или иных реакций, что определяется состоянием клетки и
окружающей среды. Изменение статуса GSH может наблюдаться как при нормальных физиологических ситуациях, так и
при стрессах. Для ингибирования синтеза GSH у эукариот широко используется ингибитор γ-глутамилцистиинсинтетазы
[Gebhardt,1984].
Редокс-активность
глутатиона при одновременной его устойчивости к окислению кислородом, высокая
концентрация и возможность поддержания в восстановленном состоянии делают GSH важнейшим внутриклеточным
редокс-буфером. Редокс система глутатиона включает в себя сам глутатион, GPO и ГSТ [Davies,1995].
GSH реагирует с очень большим числом
электрофильных компонентов с образованием GSH-конъюгатов. Эта реакция
может происходить спонтанно или катализироваться ферментами GSТ, затем коньюгаты деградируют до
относительно безвредных меркаптуровых кислот. Глутатион также участвует в
детоксикации некоторых реактивных альдегидов, которые могут образовываться при
окислительных процессах в клетках. У эукариот глутатион играет ключевую роль в
защите от окислительного стресса как кофактор селенозависимых и независимых GPO (Рис. 2). При окислительном стрессе
идет интенсивное окисление GSH, и
снижение соотношения GSH/GSSG является одним из основных признаков
окислительного стресса в клетках [Brune,1995].
Защита живых организмов от окислительных повреждений не ограничивается
рассмотренными выше антиоксидантными системами, а осуществляется так же большим
количеством репарационных систем, специфическими протеолитическими ферментами;
макрофагами и гепатоцитами, эффективно захватывающими окисленные липопротеины
через специальные «скэвенджнр-рецепторы». Эта еще раз свидетельствует о
важности и сложности окислительных процессов с участием АФК, протекающих в
живом организме.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект
исследования
Объектом
исследования явились эритроциты крови практически здоровых людей, проживающих в
Советском и Октябрьском районах г. Красноярска, а так же эритроциты крови людей
с ЛОР-патологиями.
Всего обследовано
131 человек в возрасте от 18 до 54 лет, забор материала исследования проводился
в клиническо-диагностической лаборатории ГУ НИИ медицинских проблем Севера СО
РАМН. Группу контроля составили 102 практически здоровых человека, неболевших
острыми респираторными заболеваниями в течение последнего месяца и не имеющих
хронических ЛОР-заболеваний. Здоровые люди были отобраны в 2-х районах города
Красноярска ЛОР-врачом по данным клинического осмотра. Группа людей с
ЛОР-заболеваниями составила 29 человек, проживающих в различных районах г.
Красноярска.
Таблица 1
Характеристика
материала исследования и объёма проведенных работ
|
Методы исследования
|
Здоровые
|
ЛОР-больные
|
Всего
|
Определение содержания GSH в эритроцитах крови
Определение активности GPO в эритроцитах крови
Определение активности GST в эритроцитах крови
Определение активности GR в эритроцитах крови
Определение содержания гемоглобина
в эритроцитах крови
|
91
89
90
67
91
|
29
20
28
6
29
|
120
109
118
73
120
|
Всего
|
428
|
112
|
540
|
Определение
активности глутатионзависимых ферментов – GPO, GST и GR, а так же содержание GSH проводили в упакованных эритроцитах
крови (табл. 1).
2.2.
Приготовление эритроцитов
Гепаринизированную
кровь центрифугируют 20 минут при 3000 об/мин. (1700g). После центрифугирования убирают
слой плазмы и тонкую белую лейкоцитарную пленку. Плазму отбирают отдельно и
сохраняют. Оставшуюся после отбора плазмы эритроцитарную массу трижды отмывают
физиологическим раствором (0,9%-ным NaCl) и центрифугируют по 15 минут при 3000 об/мин. (1700g). Супернатант отбрасывают. Последнее
центрифугирование проводят в течение 20 минут для более плотной упаковки клеток
[Авраамова, Титова, 1978].
2.3. Определение
содержание гемоглобина
Содержание Hb определяют унифицированным
гемиглобинцианидным методом с использованием набора реактивов фирмы “Агат-Мед”.
Принцип метода заключается в следующем: Hb крови при взаимодействии с
железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в Met-Hb, образующий с ацетонциангидрином гемиглобинцианид (цианметгемоглобин),
оптическая плотность которого при 540 нм пропорциональна концентрации Hb в образце крови [Меньшиков, 1987].
Содержание Hb в опытных образцах выражали
в граммах на литр упакованных эритроцитов.
Реактивы:
1.
Трансформирующий реагент – сухая смесь натрий углекислый кислый, 1,0г, калий
железосинеродистый, 200 мг.
2. Ацетонциангидрин.
3. Калибровочный
раствор гемоглобин с концентрацией 120 г/л.
Ход
определения
К 5 мл
трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл крови (разведение в 251 раз) или
гемолизата, хорошо перемешивают. Определение проводят через 10 минут против
холостой пробы (трансформирующего раствора), окраска устойчива в
течение не менее 1 часа.
При
использовании фотоколориметра определение проводят в диапазоне длин волн 500-560 нм
(зелёный светофильтр). Калибровочный раствор гемоглобина обрабатывают также,
как и пробу цельной крови. Расчёт содержания гемоглобина производят по формуле:
,
где:
Hb – содержание гемоглобина в опытной
пробе, г/л;
Dо – оптическая плотность опытной
пробы;
Dx – оптическая плотность калибровочной
пробы;
120 – содержание
гемоглобина в калибровочном растворе, г/л.
2.4. Определение
количества восстановленного глутатиона
Принцип метода основан на взаимодействии GSH с ДТНБК
(5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый
цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в
ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм
[Beutler, 1990].
Ход определения
Готовим гемолизат
добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О,
охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл
осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния
при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат
должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в
спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера.
Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания
должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с
ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя
1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с
опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий
раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.
Реактивы:
1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной
ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О
и доводили до метки 100 мл.
2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4
3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор,
приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия
Содержание восстановленного
глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного
аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.
Содержание
глутатиона рассчитывают по формуле:
,
где:
С – концентрация
восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;
Е1 –
оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;
Е2 –
оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;
138 – разведение
эритроцитов в реакционной пробе;
Hb – гемоглобин, г/л;
1000 –
коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;
F – отношение оптической плотности
контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после
добавления (Е2 );
13600 –
коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при
взаимодействии GSH с ДТНБК;
2.5.
Определение активности глутатионпероксидазы
Принцип
метода: глутатионпероксидаза
катализирует реакцию взаимодействия GSH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом
может быть оценена по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной
реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].
Ход
определения
Отмытые и
упакованные эритроциты гемолизировали охлаждённой до 0ºС водой в
соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивали с 0,73 мл сложного буфера и
термостатировали 10 мин при 37°С. Реакцию инициировали внесением в
реакционную смесь 0,07 мл 0,14%-ного раствора ГПТБ (коммерческий препарат).
Строго по секундомеру через 5 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением
0,2 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробы 0,14%-ный раствор ГПТБ
вносили после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 1700g
в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества
восстановленного глутатиона: к 0,1 мл супернатанта добавляли 2,65 мл 0,1 М
трис-HCl буфера. После перемешивания пробы фотометрировали на СФ-26 при длине
волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дист. Н2О.
Активность фермента в эритроцитах выражали в мкмолях GSH, окисленного за 1 минуту на грамм Hb, используя коэффициент молярной
экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона,
образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК.
Реактивы:
1. Сложный буфер:
0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид
натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH
2. 0,14%-ный
раствор трет-бутил гидропероксида
3. 20%-ный
раствор ТХУ
4. 0,1 М трис-HCl
буфер, pH8,5
5. ДТНБК на
абсолютном метаноле, 0,01М
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|