| Взаимодействия белков с РНК – структурный компьютерный анализ |
Не так давно,
двумя группами независимо были предложены стохастические алгоритмы 6-мерного
поиска, которые позволили создать программы, ставшие стандартным инструментом в
рентгеновской кристаллографии макромолекул:
1)
В работе
Киссинджера и др. [26] был применен так называемый эволюционный алгоритм,
который принадлежит к семейству алгоритмов стохастической оптимизации,
включающему такие методы как Монте-Карло [28] и медленный отжиг [25].
2)
Генетический
алгоритм, независимо предложенный Чангом и Льюисом [14], основан на том же
самом принципе, что и эволюционный и отличается от последнего лишь некоторыми
деталями реализации. Подобный подход применялся также для разработки процедуры
поиска положений тяжелых атомов в тяжелоатомных производных кристаллов макромолекул
[13] и в прямых методах расчета фаз для кристаллов вирусных частиц [29].
Эволюционный
алгоритм использует принцип естественного отбора для нахождения оптимальных
решений. Вначале генерируется набор случайных решений, задающих одновременно и
ориентацию и положение модели в элементарной ячейке. Затем рассчитываются
структурные факторы Fm для каждого решения и производится
отбор лучших решений исходя из коэффициента линейной корреляции [26].
Отобранные
решения сохраняются и используются для создания нового набора с тем же
количеством элементов, что и в предыдущем. Недостающие элементы нового набора
получают, внося в ориентации и положения отобранных решений случайные изменения
в соответствии с нормальным распределением. Таким образом, плотность распределения
элементов нового набора уже не будет равномерной, а будет иметь максимумы в
окрестностях отобранных решений. Затем снова происходит расчет структурных
факторов Fm, отбор лучших решений, создание
следующего набора, и так далее, пока не будет получено решение с некоторым
оптимальным значением коэффициента линейной корреляции. На последней стадии,
для лучшего отобранного решения проводится оптимизация ориентации и положения
модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов [33].
Скорость 6-мерного
поиска с использованием эволюционного алгоритма значительно увеличивается за
счет применения метода непрерывных преобразований структурных факторов [14,
26]. В этом методе структурные факторы рассчитываются один раз с помощью
быстрого преобразования Фурье (FFT) для
модели, помещенной в начало координат искусственной ячейки симметрии P1. В ходе 6-мерного поиска, изменение
ориентации модели учитывается путем ортогональных преобразований индексов
обратной решетки и использования линейной интерполяции в обратном пространстве.
Изменение положения модели учитывается применением соответствующих фазовых
сдвигов. При этом, принимаются во внимание вклады всех симметрически связанных
молекул.
Одной из
серьезных проблем, возникающих при уточнении фаз, полученных методом
молекулярного замещения, является так называемая “model-bias” проблема [34]. Эта проблема проявляется в том, что если часть модели не
соответствует реальной структуре, то на карте электронной плотности,
рассчитанной по модели, данный участок будет в большей степени соответствовать
модели чем реальной структуре. Традиционно, эта проблема решается с помощью OMIT карт электронной плотности,
рассчитанных по модели, из которой исключен интересующий участок. С введением
Брюнгером в программу CNS [6] возможности модификации
электронной плотности рассчитанной по модели, появился еще один способ решения
этой проблемы.
Таким
образом, метод молекулярного замещения представляет собой мощный инструмент в
кристаллографии макромолекул, который в случае высокой гомологии позволяет
быстро и эффективно решать фазовую проблему. По мере того как количество известных
структур макромолекул неуклонно растет, метод молекулярного замещения становится
все более и более актуальным.
Сбор
дифракционных данных комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант) проводился на синхротроне ESRF (Гренобль, Франция), линия ID14 С использованием детектора Mar CCD (l= 0.93300 Å; Т=100К).
Полученные данные
обрабатывали программами DENZO
и SCALEPACK. Обработка данных имеет ряд
этапов:
1) Выделение сильных рефлексов;
2) Предсказание обратной
решётки;
3) Определение пространственной
группы и параметров ячейки;
4) Уточнение параметров
кристалла и детектора;
5) Обработка всех имеющихся
изображений;
6) Приведение рефлексов к общей
шкале;
7) Интегрирование рефлексов по
всему обратному пространству.
В результате мы
получили набор дифракционных данных в обратном пространстве.
Первоначальный
набор фаз получен с помощью метода молекулярного замещения. Основой для модели
послужила структура с заменой Met на SeMet комплекса S15(I11M+A79M)-16SрРНК.
Для решения
задачи молекулярного замещения использовалась процедура оптимизации ориентации
и положения модели как твердого тела по методу сопряженных градиентов. Расчеты
проводились с помощью программы комплекса CNS RIGIT-BODY REFINEMENT. Полученный R-фактор (0,339), показал, что при
общей гомологии комплексов (»99%) всё же наблюдается расхождение в боковых цепях и
петлях.
Первоначально
были проведены несколько циклов автоматического (программой CNS)
кристаллографического уточнения, которое включало в себя
молекулярно-динамическую процедуру моделированного отжига (ANNELING), проводимую во
внутренних координатах; уточняемыми параметрами были торсионные углы. При этом
использовались ограничения (типа “restraints”) в соответствии с операцией
некристаллографической симметрии.
Затем
были получены две карты электронной плотности:
1)
карта, рассчитанная с использованием коэффициентов 2fo-fc, где fo – структурный фактор,
полученный экспериментально на основе дифракционных данных, fc – структурный фактор,
рассчитанный на основе модели
2)
composit-omit map – разностная 2fo-fc карта, где fc определяется как комбинированная
величина, рассчитанная по нескольким моделям с исключением 5% атомов на каждом
шаге.
Полученные
карты были хорошего качества, что позволило вписать все боковые остатки белка,
уточнить положение главной цепи и молекулы РНК. Для ручной правки использовалась
программа молекулярной графики О.
Окончательное
уточнение включало уточнение параметров длин связей и углов с помощью программы
MINIMIZE (CNS), уточнение
В-факторов для индивидуальных атомов, а так же проверку стереохимии полученной
структуры и расстояний между атомами (водородные связи, Ван-дер-Вальсовы
взаимодействия, «плохие» расстояния).
Окончательная
модель, уточненная до значений R-фактора ***8% и Rfree ***% при разрешении до 2,8Е, включает ** аминокислотных остатков
и ** нуклеотидов. Кроме того были локализованы *** молекул воды, ** ионов ионов
Mg+2 в независимой части элементарной
ячейки. Общее число атомов модели в независимой части элементарной ячейки составило
****. Модель обладает хорошими стехиометрическими параметрами и не содержит остатков, расположенных в запрещенных
областях карты Рамачандрана. Часть окончательной 2Fo-Fc карты электронной плотности на уровне 1.5 s показана на рис. 20.
Структура комплекса S15-16SрРНК схематически показана на
рис. 21. Координаты атомов окончательной модели комплекса S15-16SрРНК занесены в RCSB Protein Data Bank (код ****).
В результате
проделанной работы была построена модель структуры комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).
Модель была
уточнена до R-фактора 24,5% и Rfree 30,9% при разрешении до 2,9Е, и включает 86 аминокислотных
остатков и 57 нуклеотидов. Общее число атомов модели в независимой части
элементарной ячейки составило 1943. Модель обладает хорошими стехиометрическими
параметрами и не содержит остатков, расположенных в
запрещенных областях карты Рамачандрана.
Таблица 2.2.1. Статистика уточнения структуры
комплекса комплекса
S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)
|
Пространственная
группа
|
Р6422
|
Параметры
ячейки (Е)
|
a=128.228, b= 128.2286, c=64.9505
|
Длина
волны (Е)
|
0,933
|
Разрешение
(Е)
|
500 - 2,9
|
Избыточность
|
5,9
|
Полнота
набора (%)
|
98,0
|
Rsym (%)
|
3,1
|
Rcryst/Rfree (%)
|
24,5/30,9
|
Разрешение
(Е)
|
6,0 – 2,9
|
Число
рефлексов
|
8209
|
Вср (Е)
|
44,8
|
R.m.s.d.
связей (Е)
|
0,006
|
R.m.s.d.
углов (°)
|
1,2
|
Как видно из
рисунка 2.2.1., белок S15 относится к семейству a-спиральных белков и состоит
из четырёх a-спиралей, взаимодействующих с 16SрРНК и стабилизирующих данную структуру.
Фрагмент 16S рРНК из T.thermophilus (рис. 2.2.2.) длиной 57 нт состоит
из укороченных спиралей Н20, Н21 и Н22. Спираль Н22 стыкуется со спиралью Н21,
образуя вытянутую структуру, а спираль Н20 прилегает к ней под углом примерно в
60°.
рис.2.2.1. Структура белка S15 (T3C мутант)
рис. 2.2.2. Структура
фрагмента 16S рРНК
Белок S15 распознаёт на поверхности РНК два
удалённых участка, один из которых располагается в верхней части спирали H22, а другой – в районе соединения
трёх спиралей РНК (рис. 2.2.3.). Участки отстают друг от друга на один виток
спирали.
рис.2.2.3.
Структура комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант)
1.
Получен и
обработан набор дифракционных данных для комплекса S15-16SрРНК (S15 T3C мутант).
2.
Методом
молекулярного замещения определена структура комплекса.
3.
Показано,
что рибосомный белок комплекса S15
связывается с 16S рРНК в двух пространственно
удалённых участках.
4.
Показано,
что мутация Т3С не изменяет пространственной структуры комплекса и структуры
РНК-белкового интерфейса.
1.
Серганов А.А. (1997) Изучение РНК-связывающих
свойств рибосомного белка S15 из Thermus thermophilus.
Диссертация, МГУ.
2.
Anston
A.A., Otridge J., Brzozowski A.M., Dodson E.J., Dodson G.G., Wilson K.S., Smith
T.M., Yang M., Kurecki T., Gollnick P. (1995). Biochemestry. 18:
693-700
3.
Argos
P. & Rossmann M.G. (1980) in “Theory and Practice of Direct Methods in
Crystallography” (Ladd and Palmer, eds.), pp.361-417. Plenum, New York.
4.
Bentley
G.A. & Houndusse A. (1992), Acta Cryst. A48, 312-322.
5.
Blundell
T.L. & Johnson L.N. (1974) Protein Crystallography. Academic Press, New
York.
6.
Brunger
A.T., Adams P.D., Clore G.M., DeLano W.L., Gros P., Grosse-Kunstleve R.W., Jiang
J., Kuszewski J., Nilges M., Pannu N.S., Read R.J., Rice L.M., Simonson T.,
Warren G.L. (1998) Crystallography & NMR System: A New Software Suite for
Macromolecular Structure Determination. Acta Cryst. D54, 909-921.
7.
Brunger
A.T., Milburn M.V., Tong L., de Vos A.M., Jancarik J., Yamazumi Z., Nishimura
S., Ohtsuka E., Kim S.-H. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,
4849-4853.
8.
Burd
C.G. Dreifuss G. (1994). Conserved structures and diversity of functions of
RNA-binding proteins. Science 265: 615-620
9.
Bycroft
M., Grunert S., Murzin A., Proctor M., Johnston D. (1995). NMR solution
structure of a dsRNA binding domain from Drosophila staufen protein reveals
homology to the N-terminal domain of ribosomal protein S5. EMBO J. 14:
3563-3571
10. Bycroft
M., Hubbard T.J.P., Proctor M., Freund S.M.V., Murzin A. (1997). The solution
structure of the S1 RNA binding domain: a member of an ancient nucleic
acid-binding fold. Cell 88: 235-242
11. Castellano
E., Oliva G., Navaza J. (1992), J. Appl. Cryst. 25, 281.
12. Cate
J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Szewczak A.A., Kundrot
C.E., CechT.R., Doudna J.A. (1996). RNA tertiary structure mediation by
adenosine platforms. Science 273: 1696-1699
13. Chang
G. & Lewis M. (1994), Acta Cryst. D50, 667-674.
14. Chang
G. & Lewis M. (1997) Molecular Replacement Using Genetic Algorithms. Acta
Cryst. D53, 279-289.
15. Crowther
R.A. & Blow D.M. (1967), Acta Cryst. 23, 544-548.
16. Crowther
R.A. (1972) in “The Molecular Replacement Method”, Int. Sci. Rev. No.13
(Rossmann M.G., ed.). Gordon & Breach, New York.
17. Draper
D.E. (1995). Protein-RNA recognition. Annu. Rev. Biochem. 64:
593-620
18. Draper
D.E. (1996) Ribosomal protein-RNA interactions. In Ribosomal RNA: structure, evolution,
processing and function in protein biosynthesis. Eds. Zimmermann R.A.,
Dahlberg A.E. Boca Raton, Florida, CRC Press, 171-198
19. Franklin
C., Shi J.P., Shimmel P. (1992). Overlapping nucleotide determinante for
specific aminocylation of RNA. Science. 225: 1121-1125
20. Fujinaga
M. & Read R.J. (1987), J. Appl. Cryst. 20, 517-521.
21. Harada
Y., Lifchitz A., Berthou J., Jolles P. (1981), Acta Cryst. A37,
398-406.
22. Huber
R. (1965), Acta Cryst. A19, 353-356.
23. Kjems
J., Egebjerg J., Christiansen J. (1998) Laboratory techniques in biochemistry
and molecular biology. Elsevier, 237
24. Kim
J.L., Nikolov D.B., Burley S.K. (1993). Co-crystal structure of TBP recognizing
the minor groove of a TATA element. Nature 365: 520-527
25. Kirkpatrick
S., Gelatt C.D. Jr & Vecchi M.P. (1983), Science, 220,
671-680.
26. Kissinger
C.R., Gehlhaar D.K., Fogel D.B. (1999) Rapid automated molecular replacement by
evolutionary search. Acta Cryst. D55, 484-491.
27. Marino
J.P., Gregorian R.S., Csankovski G., Grothers D.M. (1995). Ent helix formation
between RNA hairpins with complementary loops. Science 268:
1448-1254
28. Metropolis
N., Rosenbluth A.W., Rosenbluth M.N., Teller A. & Teller E. (1953), J.
Chem. Phys. 21, 1087-1092.
29. Miller
S.T., Hogle J.M. & Filman D.J. (1996), Acta Cryst. D52,
235-251.
30. Musco
G., stier G., Joseph C., Morelli M.A.C., Nilges M., Gibson T.J., Pastore A..
(1996) Thre-dimensional structure and stability of the KH domain: molecular
insight into the fragile X syndrome. Cell 85: 237-245
31. Nevskaya,
N., Tishchenko, S., Nikulin, A., Al-Karadaghi, S., Liljas, A., Ehresmann, B.,
Ehresmann, C., Garber, M., Nikonov, S. (1998) Crystal Structure of Ribosomal
Protein S8 from Thermus Thermophilus Reveals a High Degree of Structural
Conservation of a Specific RNA Binding Site. J.Mol.Biol. 279, 233-244.
32. Normanly
J., Abelson J. (1989). TRNA identity. Annu. Rev. Biochem. 58:
1029-1049
33. Powell
M.J.D. (1977), Math. Programming, 12, 241-254.
34. Read
R.J. (1997) Model Phases: Probabilities and Bias. In Methods in Enzymology,
277, 110-128, Academic Press.
35. Read
R.J. & Schierbeek A.J. (1988), J. Appl. Cryst. 21, 490-495.
36. Rossmann
M.G., Blow D.M., Harding M.M., Coller E. (1964), Acta Cryst. 17,
338-342.
37. Rossmann
M.G. & Blow D.M. (1962), Acta Cryst. 15, 24-31
38. Schindelin
H., Marahiel M.A., Heinemann U. (1993). Universal nucleic acid-binding domain
revealed by crystal structure og the B.subtilis major cold-shock domain. Nature
364: 164-168
39. Seeman
N., Rosenberg J.M., Rich A. (1976). Sequence-specific recgnition of double
helical nucleic acids by proteins. Pros. Natl, Acad. USA 73:
804-808
40. von
Hippel P.H., McGhee J.D. (1972). DNA-protein interactions. Annu. Rev.
Biochem. 41: 231-298
41. Weeks
K.M., Crothers D.M. (1993). Major grove accessibility of RNA. Science 261:
1574-1577
Страницы: 1, 2, 3
|